Kumpulan Metode Uji Biomolekuler

SDS PAGE VSMC

Pembuatan Separating Gel 12.5 %

1.      30 Acrylamide 2.08 ml

2.      Separating Buffer 1.25 ml

3.      Dionizewater 1.56 ml

4.      Sodium Dodecil Sulfat 10 % 50 ul

5.      Amoium persulfat 10 % 30 ul

6.      Temed 10 ul

Pembuatan Stacking Gel 4 %

1.      30 Acrylamide 0.27  ml

2.      Separating Buffer 0.5  ml

3.      Dionizewater 1.19 ml

4.      Sodium Dodecil Sulfat 10 % 20 ul

5.      Amoium persulfat 10 % 10 ul

6.      Temed 5 ul

Preparasi sampel

            Sampel : RSB protein = 1 : 2

Metode running

Disiapkan Plate Gel

 

Plate Diisi dengan Separating gel

 

Ditunggu sampai gel mengeras

 

Plate diisi dengan Stacking gel

 

Dimasukkan sisiran

 

Ditunggu sampai gel mengeras

 

Sisiran diambil

 

Sampel Protein dimasukkan kedalam sumuran gel

 

Gel dirunning pada 80 V selama ± 80 menit

 

Gel di Silver Staining

Proses Silver staining

Gel Hasil SDS Page

 

Difiksasi menggunakan methanol selama 30 menit

Dishaker

Sensitizing buffer selama 30 menit

 

Dihaker

Cuci dengan Dionize water 3 X 5 menit

Dishaker

 

Diinkubasi dengan Silver Reaksi selama 20 menit

 

Dishaker

Cuci dengan Dionize water 1 X 3 menit

Developing sampai pita-pita gel muncul

Stop Reaksi

WESTERN BLOTING

Pembuatan Separating Gel 12.5 %

7.      30 Acrylamide 2.08 ml

8.      Separating Buffer 1.25 ml

9.      Dionizewater 1.56 ml

10.  Sodium Dodecil Sulfat 10 % 50 ul

11.  Amoium persulfat 10 % 30 ul

12.  Temed 10 ul

Pembuatan Stacking Gel 4 %

7.      30 Acrylamide 0.27  ml

8.      Separating Buffer 0.5  ml

9.      Dionizewater 1.19 ml

10.  Sodium Dodecil Sulfat 10 % 20 ul

11.  Amoium persulfat 10 % 10 ul

12.  Temed 5 ul

Preparasi sampel

            Sampel : RSB protein = 1 : 2

Metode :

            1. Proses Pembuatan Gel

Disiapkan Plate Gel

 

Plate Diisi dengan Separating gel

 

Ditunggu sampai gel mengeras

 

Plate diisi dengan Stacking gel

 

Dimasukkan sisiran

 

Ditunggu sampai gel mengeras

 

Sisiran diambil

 

Sampel Protein dimasukkan kedalam sumuran gel

 

Gel dirunning pada 80 V selama ± 80 menit

            2. Proses Transfer sampai Pewarnaan

Gel Hasil SDS Page direndam akuades selama 5 menit

 

Dibasahi dengan tranfer buffer selama 30 menit

 

Membran NC dibasahi dengan transfer buffer selama 10 menit

 

Filter paper dan spon dibasahi dengan transfer buffer

 

White side (atas)-spon-kertas saring 3 lembar-membran NC-Gel-Kertas saring 2 lembar-spon-black side (bawah)

 

Transfer pada 100 V 2 jam pada 4^oC

 

Membran NC di staining menggunakan Ponceau selam 5 menit

 

Destaining menggunakn akuades

 

Membran NC diblocking dengan TBS skim 5 % selama 4^oC

 

Dicuci dengan TBS 2 X 5 menit

 

Inkubasi dengan antibodi Primer dalam TBS skim 1 % selama 2 jam pada suhu ruang

 

Diinkubasi dengan antibodi sekunder IgG biotin dalam TBS selama 1 jam

 

Dicuci dengan TBS 2 X 5 menit

 

Diiunkubasi dengan SA-HRP dalam TBS skim selama 1 jam

 

Dicuci dengan TBS 2 X 5 menit

Ditambah substart TMB selama ± 15 menit

 

Stop reaksi dengan akuades

ELISA

Coating Antigen 1: 20 ( sampel  : coating buffer ) @ 100 ul

inkubasi overnight pada 4 ⁰C

 

Cuci dengan PBS-T 0.1 % 2 X 5 menit @ 100 ul

 

Blocking dengan BSA 1 % dalam PBS selama 30 menit

 

Cuci dengan PBS-T 0.1 % 2 X 5 menit @ 100 ul

 

Inkubasi dengan antibodi primer selama 1 jam pada 37  ⁰C

 

Cuci dengan PBS-T 0.1 % 2 X 5 menit @ 100 ul

 

Inkubasi dengan antibodi sekunder IgG biotin selama 1 jam pada suhu ruang

 

Cuci dengan PBS-T 0.1 % 2 X 5 menit @ 100 ul

 

Inkubasi dengan SA-HRP selama 1 jam

 

Cuci dengan PBS-T 0.1 % 2 X 5 menit @ 100 ul

 

Ditambah dengan Sure Blue TMB inkubasi selama 30 menit @ 100 ul

 

Stoping reaction dengan HCl 1N inkubasi selama 15 menit @ 100 ul

 

Dibaca menggunakan Elisa Reader

PENGUKURAN MDA

Bahan	Sampel Positif	Sampel Negatif
TCA 100 %	100 ul	100 ul
Na-tio 1 %	100 ul	-
HCl 1N	250 ul	250 ul
Akuades	450 ul	550 ul
Sampel	100 ul	100 ul

 

Panaskan 100 ⁰C selama 10 menit

 

Sentrifuse 3000 rpm selama 5 menit pada suhu runag

 

Diambil Supernatan

 

Ditambah Akuades sampai dengan 3500 ul

 

Spektro pada panjang gelombang maksimum

( 500 – 600 nm )

PENGUKURAN SOD

Sel hasil Kultur

 

Sentrifuse 6000 rpm 10 menit

 

Supernatan diambil 100 ul

 

Ditambah

Bahan	Kontrol +	Kontrol -
Xantine	100 ul	100 ul
Xantine Oksidase	100 ul	100 ul
NBT	100 ul	-
PBS	3100 ul	3200 ul

Inkubasi pada 30 ⁰C selama 30 menit

( sampel tidak boleh kena cahaya )

 

Baca menggunakan Spektrofotometri pada panjang gelombang maksimum

( 500 – 600 nm )

IMUNOSITOKIMIA

Sel Kultur yang attach

 

Difiksasi menggunakan Methanol absolut

Cuci dengan PBS 3 x 5 menit

Ditambah dengan Triton-x 100 0.1 % inkubasi selama 5 menit

Cuci dengan PBS-T 0.1 % 3 x 5 menit

Ditambah dengan H2O2 3 % inkubasi selama 20 menit

Cuci dengan PBS-T 0.1 % 3 x 5 menit

Diblocking dengan NCS / FBS 5 % selama 30 menit

Cuci dengan PBS-T 0.1 % 3 x 5 menit

Diinkubasi dengan antibodi primer dalam NCS / FBS 5 % selama overnight pada 4 ⁰C

Cuci dengan PBS-T 0.1 % 3 x 5 menit

Ditambah dengan antibodi sekunder IgG biotin inkubasi selama 1 jam

Cuci dengan PBS-T 0.1 % 3 x 5 menit

Ditambah dengan SA-HRP inkubasi selama 1 jam

Cuci dengan PBS-T 0.1 % 3 x 5 menit

Ditambah dengan DAB Substrat inkubasi selama 20 menit

 

Cuci dengan akuades 3 x  5 menit

Ditambah dengan Meyer Hematoxylen inkubasi selama 10 menit

Cuci dengan air kran secukupnya

Mounting dengan entelan

IMUNOHISTOKIMIA

Preparat Organ

Cuci dengan PBS 3 x 5 menit

Ditambah dengan Triton-x 100 0.1 % inkubasi selama 5 menit

Cuci dengan PBS 3 x 5 menit

Ditambah dengan H2O2 3 % inkubasi selama 20 menit

Cuci dengan PBS 3 x 5 menit

Diblocking dengan NCS / FBS 5 % selama 30 menit

Cuci dengan PBS 3 x 5 menit

Diinkubasi dengan antibodi primer dalam NCS / FBS 5 % selama overnight pada 4 ⁰C

Cuci dengan PBS 3 x 5 menit

Ditambah dengan antibodi sekunder IgG biotin inkubasi selama 1 jam

Cuci dengan PBS 3 x 5 menit

Ditambah dengan SA-HRP inkubasi selama 1 jam

Cuci dengan PBS 3 x 5 menit

Ditambah dengan DAB Substrat inkubasi selama 20 menit

Cuci dengan akuades 3 x  5 menit

Ditambah dengan Meyer Hematoxylen inkubasi selama 10 menit

Cuci dengan air kran secukupnya

Mounting dengan entelan

IMUNOSITOKIMIA FLOROSENCE

Sel Kultur yang attach

 

Difiksasi menggunakan Methanol absolut

 

Cuci dengan PBS 3 x 5 menit

 

Ditambah dengan Triton-x 100 0.1 % inkubasi selama 5 menit

Cuci dengan PBS-T 0.1 % 3 x 5 menit

 

Ditambah dengan H2O2 3 % inkubasi selama 20 menit

Cuci dengan PBS-T 0.1 % 3 x 5 menit

Diblocking dengan NCS / FBS 5 % selama 30 menit

Cuci dengan PBS-T 0.1 % 3 x 5 menit

Diinkubasi dengan antibodi primer dalam NCS / FBS 5 % selama overnight pada 4 ⁰C

Cuci dengan PBS-T 0.1 % 3 x 5 menit

 

Ditambah dengan antibodi sekunder IgG FITC / RHODAMINE inkubasi selama 1 jam diatas ice box

Cuci dengan PBS-T 0.1 % 3 x 5 menit

 

Diamati secepatanya menggunakan mikroskop konvokal

PENGECATAN Ca²⁺-i

Sel Kultur yang hidup

 

Dicuci dengan PSS buffer free Ca 3 x

 

Inkubasi dengan Fluo-3-am selama 30 menit pada suhu 37 ⁰C

 

Dicuci dengan PSS buffer free Ca 3 x

 

Amati secepatnya menggunakan mikroskop konvokal

PENGUKURAN CASPASE ACTIVITY

Sel Hasil Kultur

Ditambah 50 ul sel lysis buffer

 

Inkubasi on ice selama 10 menit

Sentrifuse 10250 rpm selama 1 menit pada suhu 4⁰C

Diambil supernatan sedangkan pellet dibuang

Ditambah 50 ul sel lysis buffer

Dihomogenasi

 

Diambil 50 ul larutan ditambah dengan 50 ul buffer raction 2x

Ditambah 5 ul DEVD-pNA 4 mM substrat

Coating pada plate Elisa

Tutup dengan Aluminium Foil

Inkubasi pada suhu 37⁰C selama 2 jam

Dibaca menggunakan Elisa Reader pada panjang gelombang 405 nm

DNA FRAGMENTASI

Sel media 200 ul

Sentrifuse 1500 rpm 7 menit

Pellet diinkubasi dengan DNA lysis buffer 100 ul

Inkubasi selama 10 menit

Sentrifuse 4210 rpm selama 5 menit

 

Supernatan ditampung pada eppendorf A

Pellet diinkubasi dengan DNA lysis buffer 100 ul

Inkubasi selama 10 menit

Sentrifuse 4210 rpm selama 5 menit

Supernatan ditampung pada eppendorf A

Supernatan total ditambah dengan SDS 1 % 100 ul

Diiunkubasi dengan RNAse A 100 ul 5 ug/ml selama 2 jam pada 56 ⁰C

Diinkubasi dengan Proteinase K 40 ul selama 2 jam

Ditambah dengan  ½ Volume Amonium Asetat 10 M

DNA dipresipitasi dengan methanol absolut 2.5 ml

 

Sentrifuse 11230 rpm selama 10 menit

Elektroforesis pada gel agarose 1.5 %

ISOLASI DNA METODE KIT ROCHE

Eppendorf  1500 ul

Ditambah 50 ul sampel

Ditambah 200 ul tisue lysis buffer

Ditambah 40 ul Proteinase K

Dihomogenase

Inkubasi selama 1 jam pada 55 ⁰C

Ditambah binding buffer 200 ul inkubasi selama 10 menit pada suhu 70 ⁰C

Ditambah 100 ul isopropanol

Dihomogenase

Masukkan sampel pada highpure filter yang telah digabung dengan collection tube

Sentrifuse 9172 rpm selama 1 menit

Buang collection tube diganti dengan yang baru

Ditambah 500 ul inhibitor removal

Sentrifuse 9172 rpm selama 1 menit

Buang collection tube diganti dengan yang baru

Ditambah wash buffer 500 ul

Sentrifuse 9172 rpm selama 1 menit

Ditambah wash buffer 500 ul

Sentrifuse 12000  rpm selama 10 detik

 

Buang collection tube diganti dengan yang baru

Ditambah dengan elusion buffer 200 ul

( sebelumnya elusion buffer dipanaskan pada suhu 70 ⁰C )

Sentrifuse 9172 rpm selama 1 menit

DNA disimpan pada -20 ⁰C

ISOLASI RNA METODE TRI REAGENT

50 ul sel kultur

Ditambah 1 ml Tri Reagent

Inkubasi selama 5 menit pada suhu ruang

Ditambah 200 ul kloroform

Dihomogenase

Inkubasi 2-15 menit pada suhu ruang

Sentrifuse 11230 rpm inkubasi selama 15 menit pada suhu 4 ⁰C

Ambil supernatan masukkan dalam tube baru

Ditambah 500 ul isopropanol

Dihomogenase

Inkubasi 5-10 menit

Sentrifuse 11230 menit selama 8 menit

Pellet RNA ditambah ethanol 70 % 1 ml

Sentrifuse 9522 rpm selama 5 menit

Sentrifuse 11230 menit selama 8 menit

Pellet RNA dikering anginkan selama 3-5 menit

Dilarutkan dalam SDS 0.5 %

Diinkubasi 10-15 menit pada suhu 55-60 ⁰C

RNA disimpan pada -20 ⁰C

ISOLASI DNA METODE TRI REAGENT

Interphase dan Organicphase

Ditambah ethanol absolut

300 ul / 1 ml tri reagent

Dihomogenase dan diamkan 2-3 menit pada suhu ruang

Sentrifuse 4580 rpm selama 5 menit pada suhu 4 ⁰C

Cuci pelet DNA dengan 0.1 M Natrium sitrat

1 ml / 1 ml tri reagent

Diamkan selama 30 menit

 

Sentrifuse 4580 rpm selama 5 menit pada suhu 4 ⁰C

Suspensi pellet DNA dengan etanol 70%

1 ml / 1 ml tri reagent

Pindahkan supernatan

Larutakan pelet DNA dengan 8 mM NaOH

Dipipeting perlahan

 

Sentrifuse 11230 rpm selama 10 menit

Supernatan dibuang

Simpan pelet DNA pada suhu -20 ⁰C